Evaluación del crecimiento celular y consumo de sustrato a partir del establecimento de suspensiones celulares de borojoa patinoi cuatrec (página 2)
Metodología
1.1 Establecimiento in vitro de los
explantesLa desinfección de la semilla y la
obtención de plántulas in vitro se
realizó siguiendo el protocolo
reportado por Martínez et al 2006. Una vez
obtenidas las plántulas in vitro, se tomaron
las hojas como explante para la inducción de callos friables,
éstas se sembraron bajo condiciones estériles
siguiendo el protocolo reportado por Martínez et
al 2006 con modificaciones en la concentración de
Sacarosa a 30 g/L y duplicando la concentración de
vitaminas
del medio Murashige Skoog 1962. El subcultivo de los callos a
medio fresco fue llevado a cabo cada cuatro semanas. Los
callos fueron mantenidos a condiciones de luz total y
una temperatura promedio de 28°C.1.2 Establecimiento de las suspensiones
celulares1.2.1 Desagregación celular
Para determinar el tiempo de
desagregación celular se empleó el medio
líquido Murashige Skoog (MS) (1962) con la misma
composición que fue usado para la obtención de
callos friables con la adición de Ampicilina de grado
reactivo a una concentración de 100 mg/L, el pH inicial
fue de 5.8, la concentración inicial del
inóculo fue de 20 gr Base Húmeda/L, con
agitación orbital de 160 rpm y condiciones de luz
total. Los callos utilizados en este ensayo
tenían 8 semanas de edad. El muestreo se
realizó por vaciado en tubos de centrífuga
estériles y el monitoreo del crecimiento celular se
realizó por el método de peso fresco y peso seco
reportado por Habeych 2003.El desagregado celular se pasó a
través de un tamiz en condiciones
estériles. Se tomó una parte de
éste por cada tres partes de medio fresco
según lo reporta Roca et al.
(1993).- Establecimiento de las suspensiones
celulares - Análisis
Estadístico
El efecto de los diferentes tratamientos se
analizó estadísticamente mediante análisis de Varianza (ANOVA) y
análisis de contraste de rangos múltiples con un
95% de confianza, utilizando el programa
STATGRAPHICS Plus para Windows
Versión 5.0.
1.2.4 Cinética de crecimiento de las
suspensiones celulares
La cinética de crecimiento se evaluó en el
medio de cultivo MS suplementado con sacarosa (30 g/L),
Ampicilina (100 mg/L) y 2,4-D de acuerdo con el diseño
de experimentos. El
crecimiento celular se monitoreó mediante el método
de peso fresco y peso seco de las células,
descrito por Habeych (2003). Los tratamientos se realizaron por
duplicado y el muestreo se realizó por triplicado, el
sobrenadante obtenido se almacenó a -4°C y
posteriormente fue empleado para la cuantificación de
proteína total extracelular por el método de Lowry,
para la cuantificación de azúcares reductores por
el método DNS, para
cuantificación de azúcares no reductores por el
método DNS con hidrólisis ácida y para la
determinación de metabolitos secundarios extracelulares
por cromatografía de capa fina.
2.
Resultados y Discusión
2.1 Establecimiento in vitro de los
explantes
Se logró establecer el cultivo de callos friables
in Vitro utilizando hojas provenientes de las
plántulas mediante el protocolo reportado por
Martínez et al. (2006), con modificaciones en la
cantidad de sacarosa y vitaminas. A partir del día 8 y
hasta los 20 días de cultivo, se comenzó a observar
la presencia y formación de callos friables bajo
condiciones de luz permanente. Esta modificación en el
protocolo duplicó la velocidad de
formación de los callos con respecto a la velocidad
reportada por Martínez et al. (2006).
2.2 Establecimiento de las suspensiones
celulares
El tiempo de desagregación celular a las
condiciones evaluadas para B. patinoi fue de 6
días, esto se determinó cuantitativamente mediante
una cinética de crecimiento y cualitativamente mediante la
observación de las suspensiones Foto
1.
a – b
Foto 1 Aspecto de las suspensiones al
inicio (a) y al final de la desagregación celular
(b)
Durante el periodo de desagregación se
evaluó la viabilidad celular siguiendo el protocolo de
tinción de Evans reportado por Giménez et
al. (2004). En la Foto 2 se muestran células
individuales ligeramente redondeadas, completas, con organelas,
lo cual indica el buen estado de la
pared celular, característica de células en activo
crecimiento.
a – b
c – d
Foto 2 Células típicas
de borojó en periodo de
desagregación
2.2.1 Cinética de crecimiento
celular
Los resultados del crecimiento celular para los cuatro
tratamientos se muestran en la Gráfica 1 donde se
apreció que la duración de la fase lag es de
aproximadamente cuatro días, momento en el cual inicia la
fase exponencial con una duración de 5 días la cual
finaliza aproximadamente el día 9 del cultivo, al final de
la fase exponencial se presenta una caída en el
crecimiento celular
Gráfica 1 Cinética de
crecimiento celular de B. patinoi para los tratamientos A, B, C y
D
Con base en los análisis realizados entre los
tratamientos A y C y B y D se determinó que la hormona no
tiene ningún efecto diferencial en el crecimiento celular
cuando existe la presencia de luz, por el contrario, bajo
ausencia de la luz, el 2,4-D produce mayor crecimiento celular,
sin embargo, es indiferente cual de los factores se encuentre
presente, siempre y cuando haya presencia de al menos uno de
ellos se produce crecimiento celular.
2.2.2 Cuantificación de proteína total
extracelular
Se cuantificó el contenido de proteína
total extracelular en el medio, en el cual se evidencia que el
contenido de proteínas
aumentó con la edad del cultivo, presentándose
mayor producción de proteína en el
día nueve, coincidiendo con el tiempo de mayor
producción de biomasa.
Gráfica 2.
Cuantificación de Proteína total
extracelular
La presencia de al menos un factor (hormona 2,4-D o luz)
(tratamiento A o B) favorece la producción de
proteína extracelular en un 44.91% sobre la presencia de
ambos factores (tratamiento C) y de un 58.14% sobre el control
(tratamiento D), estos porcentajes corresponden al final de la
fase exponencial (día nueve de cultivo). La mayor
concentración de proteína obtenida fue de 6.88 g/l
en el tratamiento B (2,4-D, no luz); de 6.58 g/l en el
tratamiento A (luz, no 2,4-D), 3.79 g/l en el tratamiento C (luz,
2,4-D), en el día nueve de cultivo y de 5.93 g/l en el
tratamiento D (control) en el día once de cultivo (Ver
Gráfica 2).
La concentración de proteína se
incrementó 25 veces con respecto al día cero, misma
proporción reportada por Quiroz et al. (2002) para
suspensiones celulares de C. arabica, cabe anotar que para
B. patinoi el contenido de proteínas estuvo en el
orden de g/l mientras que para C. arabica es de
µg/l.
2.2.3 Determinación de azúcares no
reductores
Las suspensiones celulares de B. patinoi
presentaron un aumento en la concentración de
azúcares no reductores, por eso no fue posible determinar
su consumo neto,
es posible que se haya presentado producción de
exopolisacáridos, los cuales pueden haberse hidrolizado
durante el procedimiento de
cuantificación de azúcares no reductores dando
unidades de glucosa,
fructosa, glucosamina o derivados que pueden reaccionar positivos
a DNS y que son comunes en suspensiones celulares.
2.2.4 Determinación de azúcares
reductores
Se presentó un aumento en la concentración
de estos azúcares a lo largo del cultivo, de acuerdo con
lo reportado, el fruto de borojó contiene 6.4 % de
azúcares reductores, lo cual indica que no es posible
calcular un consumo neto de estos. Es posible que se haya
presentado producción de aldehídos reductores en
las suspensiones los cuales dan positivos a DNS y hayan alterado
los resultados.
2.2.5Análisis químicos
Mediante cromatografía de capa fina se
determinó la presencia de sesquiterpenlactonas
extracelulares a lo largo de todo el cultivo.
3.
Conclusiones
Se establecieron suspensiones celulares de B.
patinoi con un activo crecimiento celular cuando se
inocularon callos friables en medio líquido MS,
suplementado con 30 g/L de sacarosa, 100 mg/L de Ampicilina
(grado reactivo), 1 mg/L de 2,4-D, con un inóculo de 20 g
BH/L de callo friable con un temperatura promedio de 27 °C,
agitación orbital de 160 rpm y régimen total de
luz; determinando así que el tiempo necesario para la
desagregación celular es de 6 días, momento en el
cual se encuentran completamente separados los agregados
celulares y la suspensión luce homogénea, siendo
este el momento ideal para finalizar la etapa de
desagregación e iniciar el cultivo en suspensión de
B. patinoi.
De acuerdo con la cinética de crecimiento celular
a las condiciones evaluadas, se determinó que el tiempo de
la fase lag fue de 4 días, seguida por la fase exponencial
la cual tuvo una duración de 5 días
(finalizó en el día 9 de cultivo) y finalmente se
presentó una etapa de decline hasta el final del cultivo
el cual se mantuvo durante 15 días.
Los parámetros estudiados mostraron tener un
efecto sobre el crecimiento celular, para obtener un incremento
en la biomasa es indiferente cual de los factores se encuentre
presente, siempre y cuando haya al menos uno de ellos.
No fue posible relacionar la concentración de los
azúcares no reductores con el crecimiento celular, estos
en lugar de evidenciar un consumo presentaron una
producción neta. De la misma manera se presentó
producción de azúcares reductores. Por lo tanto, no
se encontró que dichos azúcares estuvieran
asociados al crecimiento celular en vista de que éstos
tuvieron un comportamiento
irregular.
La producción de proteína se encuentra
evidentemente asociada al crecimiento celular. El incremento de
la proteína aumentó conforme aumentó la edad
del cultivo y alcanzó una producción 25 veces
más que al inicio del cultivo.
Mediante análisis químicos se
encontró de manera cualitativa la presencia de
Sesquiterpenlactonas (sesquiterpenos), a las cuales se atribuyen
propiedades antitumorales y antimicrobianas.
Bibliografía
Giménez C. y Colmenares M. 2004. Evaluación
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biología,
Facultad experimental de ciencias.
Universidad del
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Habeych, David. 2003. Evaluación de Elicitores
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Células en Suspensión de Catharanthus
roseus. Tesis.
Universidad Nacional de Colombia.
Medellín.
Lowry, O.H. 1951. Protein measurement with the Folin
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Miller, G. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent
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Quiroz, F.R.; Rodríguez, S.C. y Loyola V.M. 2002.
Patrón proteico extracelular durante la
embriogénesis somática en suspensiones celulares de
Coffea arabica L. Centro de investigación científica de
Yucatán, México.
Roca, W; Mroginski, L. Cultivos de tejidos en la
agricultura,
fundamentos y aplicaciones. CIAT. 1993.
Carolina Caballero Múnera
Ingeniera de Procesos.
Natalia Cardona Díaz
Ingeniera de Procesos.
Con la colaboración de:
Catalina Giraldo
Ingeniera de procesos
Cesar Hernández
Biólogo MSc Biotecnología.
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